|
|
Structural studies of metal-dependent hydrolases: Histone Deacetylase 6 and Glutamate Carboxypeptidase II
Shukla, Shivam ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Stříšovský, Kvido (oponent) ; Kolenko, Petr (oponent)
Hydrolasy závislé na zinku patří do třídy metaloenzymů, které obsahují zinečnaté kationty katalyzující hydrolytické reakce. Strukturní studie těchto enzymů jsou prováděny za účelem získání detailních informací o povaze jejich trojrozměrné struktury, organizaci domén a štěpení jejich přirozených substrátů. Tato práce popisuje strukturní charakteristiku dvou různých metalohydrolas 1) lidské histondeacetylasy 6 (HDAC6) a 2) glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) s využitím odlišné sady biofyzikálních technik. HDAC6 je strukturně unikátní vícedoménový enzym složený z nestrukturovaných a globulárních domén. Reguluje množství buněčných procesů odštěpováním acetylové skupiny z postranních řetězců lysinů vyskytujících se v cílových proteinech. Je známo, že HDAC6 deacetyluje substráty odlišné od histonů jako je tubulin, Hsp90, cortactin a peroxiredoxiny. Vzhledem k jeho strukturní komplexnosti jsou dostupné strukturní informace o HDAC6 omezeny pouze na jeho globulární domény. V této studii byl použit komplexní metodický přístup založený na integraci experimentálních dat získaných několika ortogonálními biofyzikálními technikami, který umožnil tvorbu strukturního modelu HDAC6 v roztoku. Získaný model ukazuje, že díky svým nestrukturovaným oblastem HDAC6 může zaujímat více konformací a v roztoku se pravděpodobně...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Role histon deacetylázy 6 v replikačním cyklu myšího polyomaviru
Vlachová, Štěpánka ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Replikační cyklus polyomavirů je stejně jako u ostatních virů zcela závislý na hostitelských buňkách. Pro viry je důležitý nejen buněčný replikační a translační aparát, ale virovou infekci ovlivňují také další buněčné proteiny. Tato práce se zabývá rolí hlavní cytoplazmatické deacetylázy histon deacetylázy 6 (HDAC6) v replikačním cyklu myšího polyomaviru (MPyV). Podařilo se nám prokázat, že přítomnost plně funkční HDAC6 je nezbytná pro úspěšnou a produktivní infekci. Zjistili jsme, že HDAC6 ovlivňuje jak časné, tak i pozdní fáze infekce. Při inhibici, či úplně absenci tohoto proteinu v buňkách je MPyV infikuje s menší efektivitou a zároveň při infekci vzniká méně infekčního virového potomstva. Naopak při využití buněk s částečně funkční HDAC6 schopnou buď deacetylace či vazby ubiquitinu se schopnost MPyV infikovat tyto buňky zvyšuje. Analýzou hladin časného LT antigenu a pozdního strukturního proteinu VP1 jsme prokázali, že HDAC6 ovlivňuje jejich hladiny v infikovaných buňkách. Naše data také naznačují, že v replikačním cyklu MPyV je vyžadována přítomnost především ubiquitin-vazebné domény HDAC6 a s ní spojená funkce v metabolismu a degradaci virových a buněčných proteinů. V druhé části diplomového projektu jsme se zaměřili na přípravu expresních plazmidů nesoucích časnou genovou oblast kódující...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Role acetylace proteinů v životním cyklu Polyomavirů
Dostalík, Pavel ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Virová částice myšího polyomaviru je složená ze 3 strukturních proteinů: majoritní strukturní VP1 a minoritní strukturní ů ci řady proteinů mohou ovlivňovat jejich posttranslační modifikace. Tato práce se zaměřuje na to jaký dopad mají acetylace strukturních proteinů na replikační cyklus MPyV. První část této práce se zabývá acetylací proteinu VP1. Podařilo se nám prokázat, ž tento protein acetylovaný ve virové čá é to, že proces acetylace je závislý na přítomnosti minoritních proteinů aké se nám podařilo prokázat, že pro infektivitu viru je důležitá HDAC6 ejí nadprodukce snižuje infektivitu viru, stejný efek é u viru izolovaného z HDAC6 KO buněk. Naše data naznačují že VP1 protein je substrátem HDAC6. Podařilo se nám zjistit, že VP1 protein viru izolovaného z HDAC6 KO buněk íce acetylovaný ve srovnání s původním vire Ve druhé čá ěřili na N' terminální acetylace proteinu na jeho N' konci byla už dříve popsána a jeho mutace zabraňující této acetylaci vede tomu, že e takový MPyV neinfekční. Proto jsme chtěli zjistit, zda je N' terminální důležitá pro stabilitu VP3 proteinu. Naše předběžné výsledky naznačují, že N' terminálně acetylovaný VP3 divokého typu je stabilnější ve srovnání s Klíčová slova: Myší polyomavirus, HDAC6, acetylace, strukturní proteiny, posttranslační
|
|
|
Analysis of Histone Deacetylase 6/Kinesin Interactions
Nedvědová, Jana ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Intracelulární transport je zajišťován dvěma typy molekulárních motorů, kinesiny a dyneiny. Kinesin-1 zprostředkovává transport molekul and organel podél mikrotubulů směrem k jejich plus konci. Specifické protein-proteinové interakce jsou nezbytné k aktivaci kinesinu, protože volný kinesin je autoinhibován. Aktivace kinesinu je spojena se změnou jeho konformace. Aktivovaný kinesin se váže na mikrotubuly a za hydrolýzy ATP přenáší navázané molekuly a organely. HDAC6 je multifunkční protein složený z několika domén. Je důležitým regulačním faktorem v mnoha procesech týkajících se mikrotubulů. HDAC6 je totiž hlavním enzymem deacetylujícím mikrotubuly. Bylo popsáno, že inaktivace HDAC6 ovlivňuje transport na mikrotubulech, nicméně mechanismus těchto změn není znám. Inaktivace HDAC6 může tyto změny působit kvůli posttranslační modifikaci mikrotubulů nebo přímou interakcí s molekulárními motory. Tato diplomová práce je zaměřena na charakterizaci dosud nepopsané interakce mezi kinesinem-1 a HDAC6. Za tímto účelem byla provedena exprese a purifikace navržených konstruktů obou proteinů. Tyto konstrukty byly analyzovány pomocí mikroskopické termoforézy (MST) pro stanovení jejich vzájemné afinity a vodík-deuteriové výměny (HDX), kterou byly interakce popsány ze strukturního hlediska. Podle MST je afinita mezi...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Škultétyová, Ľubica ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Novák, Petr (oponent)
Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1' místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1' glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení...
|
|
|
Vliv posttranslačních modifikací minoritních proteinů a acetylace mikrotubulů na průběh infekce myším polyomavirem
Mariničová, Zuzana ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Saláková, Martina (oponent)
Virion myšího polyomaviru (MPyV) je složen z hlavního kapsidového proteinu VP1 a minoritních kapsidových proteinů VP2 a VP3. Minoritní proteiny nejsou nutné pro sestavení kapsidy, jsou ale klíčové pro infektivita virových částic. Tato práce se v první části zabývá modifikacemi VP2 a VP3, deamidací Asn na pozici 253 VP2 (137 VP3) a N-koncovou acetylací Ala VP3, které by mohly být důvodem dvojitých proužků VP2 a VP3 na SDS- PAGE. V minulosti byly připraveny mutantní genomy MPyV N253D (Asn nahrazen Asp) a N253E (Asn nahrazen Glu) simulující deamidaci a A117V (Ala nahrazen Val) se sníženou acetylací. Připravili jsme mutantní viry ve třech izolacích a potvrdili jsme, že deamidace je příčinou dvojitých proužků. Mutantní viry byly porovnány s divokým typem z hlediska efektivity infekce, vliv deamidace se ale nepodařilo prokázat. Virus s mutací A117V je neinfekční, důvodem může být snížení acetylace nebo aminokyselina na této pozici. Dále se tato práce zabývá vlivem acetylace -tubulinu na průběh infekce MPyV. Acetylace - tubulinu je studována z hlediska virové infekce z důvodu vývoje nových antivirových strategií. Po infekci MPyV se acetylace zvyšuje, není to ale důsledek změny exprese mRNA acetylačního (TAT1) nebo deacetylačního enzymu tubulinu (HDAC6). Inhibice HDAC6 pomocí tubacinu, specifického...
|
|
|
Acetylace mikrotubulů a jeji role ve virové infekci
Mariničová, Zuzana ; Horníková, Lenka (vedoucí práce) ; Forman, Martin (oponent)
Recentní poznatky o posttranslačních modifikacích nás nutí uvažovat o mikrotubulech jako o důležitém aspektu regulace buněčných funkcí a signalizace. Nejinak je tomu u té nejprozkoumanější, acetylace α- tubulinu na lysinu 40. Desítky let jsou acetylované mikrotubuly považovány za stabilní, nicméně teprve nedávno byly identifikovány konkrétní tubulin acetyltransferázy a deacetylázy. I když byla popsána důležitá role acetylace při neurodegenerativních onemocněních nebo rakovině, stále si nejsme jisti významem acetylace, jelikož její roli v patogenezi protiřečí výsledky prezentující téměř normální fenotyp mutantů v některém z enzymů acetylace. Acetylace byla také studována v souvislosti s virovou infekcí. Z dostupných poznatků vyplývá, že viry modulují signální dráhy, jejichž součástí jsou i enzymy modulující acetylaci. Po vstupu viru do buňky totiž často dochází ke zvýšení acetylace, její zabránění většinou vede k znemožnění vstupu viru do buňky. Z tohoto důvodu je potřeba se acetylací mikrotubulů a její regulací dále zabývat, bližší pochopení těchto procesů nám umožní vyvinout nová terapeutika nejen proti virové infekci, ale i dalším onemocněním. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
host ::
RSS.